Conosciuto in tutto il mondo come la Betlemme Francescana, il Santuario è un poderoso complesso architettonico che sembra sorgere dalla nuda roccia.

Nucleo originario del Santuario è la Cappella del Presepio, edificata nel 1228, anno della canonizzazione del Santo, su una grotta dove, la notte di Natale del 1223, San Francesco con l'aiuto di Messer Giovanni Velita signore di Greccio, previa autorizzazione pontificia, rappresentò per la prima volta nella storia del cristianesimo la nascita di Gesù, istituendo il primo Presepe. Essa è costituita da una piccola grotta scavata nella roccia, con una volta a botte a tutto sesto ribassato.

Sotto la moderna mensa dell'altare, la roccia viva dove il Santo depose il Simulacro di Gesù, mentre sulla parete retrostante, un pregevole affresco di scuola grottesca rappresenta, in due scene, il Presepio di Greccio e la Natività di Betlemme con l'immagine della Vergine nell'atto di allattare il Bambino Gesù. All'estremità della lunetta, la Maddalena, protettrice degli eremiti.

Nel Presepio di Greccio viene riproposta l'iconografia dell'omonima scena dipinta da Giotto nella Basilica Superiore di Assisi: Francesco, che indossa la dalmatica bianca dei diaconi, inginocchiato, adora il Bambino, in alto, a destra, il sacerdote celebra la messa.

Dietro Francesco sono raffigurati tutti gli altri protagonisti di quell'evento: in primo piano, l'uomo vestito di una lunga tunica rossa è, secondo la tradizione locale, Giovanni Velita, il nobile grecciano discendente dei conti Berardi di Celano che diventò grande amico di Francesco, alla sua sinistra, sua moglie Alticama Castelli di Stroncone ed il popolo di Greccio.

Numerosi sono i tesori artistici custoditi fra le antiche mura del Santuario.

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